本標準代替GB/T 4789.10-2008《食品衛生微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》和

GB/T 4789.37-2008《食品衛生微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌計數》。

本標準與GB/T 4789.10-2008 和GB/T 4789.37-2008 相比，主要修改如下：

——修改了標準的中英文名稱；

——修改了范圍；

——規范了樣品制備過程；

——增加了計算公式中系數1.1 的解釋；

——修改了附錄A 中胰酪胨大豆肉湯的名稱，規范為10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯；

——增加了**法金黃色葡萄球菌 Baird-Parker 平板計數和第三法金黃色葡萄球菌MPN 計數。

本標準的附錄A、附錄B、附錄C 是規范性附錄。

本標準所代替標準的歷次版本發布情況為：

——GB 4789.10-84、GB 4789.10-1994、GB/T 4789.10-2003、GB/T 4789.10-2008。

——GB/T 4789.37-2008。

1 范圍

本標準規定了食品中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的檢驗方法。

本標準**法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗；**法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計數；第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計數。

2 設備和材料

除微生物實驗室常規**及培養設備外，其他設備和材料如下：

2.1 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃。

2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.3 恒溫水浴箱：37 ℃～65 ℃。

2.4 天平：感量0.1 g。

2.5 均質器。

2.6 振蕩器。

2.7 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。

2.8 無菌錐形瓶：容量100 mL、500 mL。

2.9 無菌培養皿：直徑90 mm。

2.10 注射器：0.5 mL。

2.11 pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙。

3 培養基和試劑

3.1 10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯：見附錄A 中A.1。

3.2 7.5 %氯化鈉肉湯：見附錄A 中A.2。

3.3 血瓊脂平板：見附錄A 中A.3。

3.4 Baird-Parker 瓊脂平板：見附錄A 中A.4。

3.5 腦心浸出液肉湯(BHI) ：見附錄A 中A.5。

3.6 兔血漿：見附錄A 中A.6。

3.7 稀釋液：磷酸鹽緩沖液：見附錄A 中A.7。

3.8 營養瓊脂小斜面：見附錄A 中A.8。

3.9 革蘭氏染色液：見附錄A 中A.9。

3.10 無菌生理鹽水：見附錄A 中A.10。

4 檢驗程序

金黃色葡萄球菌定性檢驗程序見圖1。

5 操作步驟

5.1 樣品的處理

稱取25 g 樣品至盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質杯內，8000 r/min～10000 r/min 均質1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min～2 min。若樣品為液態，吸取25 mL 樣品至盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。

5.2 增菌和分離培養

5.2.1 將上述樣品勻液于36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴重時在10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯內呈混濁生長。

5.2.2 將上述培養物，分別劃線接種到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。Baird-Parker 平板36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h 或45 h～48 h。

5.2.3 金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直徑為2 mm～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。

5.3 鑒定

5.3.1 染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5 μm～1 μm。

5.3.2 血漿凝固酶試驗：挑取、Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 個或以上，分別接種到5 mL BHI和營養瓊脂小斜面，36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。

取新鮮配置兔血漿0.5 mL，放入小試管中，再加入BHI 培養物0.2 mL～0.3 mL，振蕩搖勻，置36℃±1 ℃溫箱或水浴箱內，每半小時觀察一次，觀察6 h，如呈現凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養物作為對照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進行血漿凝固酶試驗。結果如可疑，挑取營養瓊脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 ℃±1 ℃培養18 h～48 h，重復試驗。

5.4 葡萄球菌腸**的檢驗

可疑食物中毒樣品或產生葡萄球菌腸**的金黃色葡萄球菌菌株的鑒定，應按附錄B檢測葡萄球菌腸**。

6 結果與報告

6.1 結果判定：符合5.2.3、5.3，可判定為金黃色葡萄球菌。

6.2 結果報告：在25 g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。

 

 

 

 

 

 

 

7 檢驗程序

金黃色葡萄球菌平板計數程序見圖2。

 

 

 

 

8 操作步驟

8.1 樣品的稀釋

8.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內，8000r/min～10000 r/min均質1 min～2 min，或置盛有225 mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min～2 min，制成1:10的樣品勻液。

8.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。

8.1.3 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL 稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭**不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1 mL 無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。

8.1.4 按8.1.3 操作程序，制備10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1 次1 mL 無菌吸管或吸頭。

8.2 樣品的接種

根據對樣品污染狀況的估計，選擇2 個～3 個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10 倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1 mL 樣品勻液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接種量分別加入三塊Baird-Parker 平板，然后用無菌L 棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培養箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

8.3 培養

8.3.1.1 在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱36 ℃±1℃培養1 h；等樣品勻液吸收后翻轉平皿，倒置于培養箱，36 ℃±1 ℃培養，45 h～48 h。

8.4 典型菌落計數和確認

8.4.1 金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直徑為2 mm～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。

8.4.2 選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度3 個平板所有菌落數合計在20 CFU～200 CFU 之間的平板，計數典型菌落數。如果：

a）只有一個稀釋度平板的菌落數在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；

b） *低稀釋度平板的菌落數小于20 CFU 且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；

c）某一稀釋度平板的菌落數大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；

d） 某一稀釋度平板的菌落數大于200 CFU 且有典型菌落，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落數不在20 CFU～200 CFU 之間，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；

以上按公式（1）計算。

e） 2 個連續稀釋度的平板菌落數均在20 CFU～200 CFU 之間，按公式（2）計算。

8.4.3 從典型菌落中任選5 個菌落（小于5 個全選），分別按5.3.2 做血漿凝固酶試驗。

9 結果計算：

公式（1）：

T = AB/CD ………………………………………………………………… （1）

式中：

T——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數；

A——某一稀釋度典型菌落的總數；

B——某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數；

C——某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗的菌落數；

d——稀釋因子。

公式（2）：

T=(A1B1/C1+A2B2/C2)/1.1d………………………（2）

式中：

T ——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數；

A1——**稀釋度（低稀釋倍數）典型菌落的總數；

A2——**稀釋度（高稀釋倍數）典型菌落的總數；

B1——**稀釋度（低稀釋倍數）血漿凝固酶陽性的菌落數；

B2——**稀釋度（高稀釋倍數）血漿凝固酶陽性的菌落數；

C1——**稀釋度（低稀釋倍數）用于血漿凝固酶試驗的菌落數；

C2——**稀釋度（高稀釋倍數）用于血漿凝固酶試驗的菌落數；

1.1——計算系數；

d ——稀釋因子（**稀釋度）。

10 結果與報告

根據Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌的典型菌落數，按9中公式計算，報告每g（mL）樣品中金

黃色葡萄球菌數，以CFU/g(mL)表示；如T值為0，則以小于1乘以*低稀釋倍數報告。

 

11 檢驗程序

金黃色葡萄球菌MPN計數程序見圖3。

 

12 操作步驟

12.1 樣品的稀釋

按8.1進行。

12.2 接種和培養

12.2.1 根據對樣品污染狀況的估計，選擇3 個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10 倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1 mL 樣品勻液接種到10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯管，每個稀釋度接種3管，將上述接種物于36 ℃±1 ℃培養45 h～48 h。

12.2.2 用接種環從有細菌生長的各管中，移取1環，分別接種Baird-Parker平板，36 ℃±1 ℃培養45 h～48 h。

12.3 典型菌落確認

12.3.1 見8.4.1。

12.3.2 從典型菌落中至少挑取1 個菌落接種到BHI肉湯和營養瓊脂斜面，36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。進行血漿凝固酶試驗，見5.3.2。

13 結果與報告

計算血漿凝固酶試驗陽性菌落對應的管數，查MPN 檢索表（見附錄C），報告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌的*可能數，以MPN/g（mL）表示。

 

附錄A

（規范性附錄）

培養基和試劑

A.1 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯

A.1.1 成分

胰酪胨（或胰蛋白胨） 17.0 g

植物蛋白胨（或大豆蛋白胨） 3.0 g

氯化鈉 100.0 g

磷酸氫二鉀 2.5 g

丙酮酸鈉 10.0 g

葡萄糖 2.5 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 7.3±0.2

A.1.2 制法

將上述成分混合，加熱，輕輕攪拌并溶解，調節pH，分裝，每瓶225 mL，121 ℃高壓**15 min。

A.2 7.5%氯化鈉肉湯

A.2.1 成分

蛋白胨 10.0 g

牛肉膏 5.0 g

氯化鈉 75 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 7.4

A.2.2 制法

將上述成分加熱溶解，調節pH，分裝，每瓶225 mL，121 ℃高壓**15 min。

A.3 血瓊脂平板

A.3.1 成分

豆粉瓊脂（pH7.4～7.6） 100 mL

脫纖維羊血（或兔血） 5 mL～10 mL

A.3.2 制法

加熱溶化瓊脂，冷卻至50 ℃，以無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。

A.4 Baird－Parker瓊脂平板

A.4.1 成分

胰蛋白胨 10.0 g

牛肉膏 5.0 g

酵母膏 1.0 g

丙酮酸鈉 10.0 g

甘氨酸 12.0 g

氯化鋰（LiCl·6H2O） 5.0 g

瓊脂 20.0 g

蒸餾水 950 mL

pH 7.0±0.2

A.4.2 增菌劑的配法

30%卵黃鹽水50 mL 與經過**過濾的1%亞碲酸鉀溶液10 mL 混合，保存于冰箱內。

A.4.3 制法

將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調節pH。分裝每瓶95 mL，121 ℃高壓**15 min。

臨用時加熱溶化瓊脂，冷至50 ℃，每95 mL 加入預熱至50 ℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5 mL 搖勻后傾注

平板。培養基應是致密不透明的。使用前在冰箱儲存不得超過48 h。

A.5 腦心浸出液肉湯(BHI)

A.5.1 成分

胰蛋白質胨 10.0 g

氯化鈉 5.0 g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O） 2.5 g

葡萄糖 2.0 g

牛心浸出液 500 mL

pH 7.4±0.2

A.5.2 制法

加熱溶解，調節pH，分裝16 mm×160 mm 試管，每管5 mL 置121 ℃，15 min **。

A.6 兔血漿

取檸檬酸鈉3.8 g，加蒸餾水100 mL,溶解后過濾，裝瓶，121 ℃高壓**15 min。

兔血漿制備：取3.8%檸檬酸鈉溶液一份，加兔全血四份，混好靜置 (或以3000 r/min 離心30 min)，

使血液細胞下降，即可得血漿。

A.7 磷酸鹽緩沖液

A.7.1 成分：

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 34.0 g

蒸餾水 500 mL

pH 7.2

A.7.2 制法：

貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調節

pH至7.2，用蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。

稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，分裝于適宜容器中，121 ℃高壓**15 min。

A.8 營養瓊脂小斜面

A.8.1 成分

蛋白胨 10.0 g

牛肉膏 3.0 g

氯化鈉 5.0 g

瓊脂 15.0 g～20.0 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 7.2～7.4

A.8.2 制法

將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內，加入15%氫氧化鈉溶液約2 mL調節pH至7.2～7.4。加入瓊

脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化，分裝13 mm×130 mm管，121 ℃高壓**15 min。

A.9 革蘭氏染色液

A.9.1 結晶紫染色液

A.9.1.1 成分

結晶紫 1.0 g

95％乙醇 20.0 mL

1％草酸銨水溶液 80.0 mL

A.9.1.2 制法

將結晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.9.2 革蘭氏碘液

A.9.2.1 成分

碘 1.0 g

碘化鉀 2.0 g

蒸餾水 300 mL

A.9.2.2 制法

將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300 mL。

A.9.3 沙黃復染液

A.9.3.1 成分

沙黃 0.25 g

95％乙醇 10.0 mL

蒸餾水 90.0 mL

A.9.3.2 制法

將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

A.9.4 染色法

a) 涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染液，染 1 min，水洗。

b) 滴加革蘭氏碘液，作用 1 min，水洗。

c) 滴加 95％乙醇脫色約15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。

d) 滴加復染液，復染 1 min，水洗、待干、鏡檢。

A.10 無菌生理鹽水

A.10.1 成分

氯化鈉 8.5 g

蒸餾水 1 000 mL

A.10.2 制法

稱取8.5ｇ氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓**15 min。

 

 

附錄B

(規范性附錄)

葡萄球菌腸**檢驗

B.1 試劑和材料

除另有規定外，所用試劑均為分析純，試驗用水應符合GB/T 6682對**水的規定。

B.1.1 A、B、C、D、E 型金黃色葡萄球菌腸**分型ELISA 檢測試劑盒。

B.1.2 pH 試紙，范圍在3.5～8.0，精度0.1。

B.1.3 0.25 mol/L、pH8.0 的Tris 緩沖液：將121.1g 的Tris 溶解到800mL 的去離子水中，待溫度冷至

室溫后，加42 mL 濃HCl，調pH 值至8.0。

B.1.4 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液：稱取NaH2PO4·H2O 0.55g（或NaH2PO4· 2H2O 0.62g）、Na2HPO4·2H2O

2.85g（或Na2HPO4·12H2O 5.73g）、NaCl 8.7g 溶于1 000 mL 蒸餾水中，充分混勻即可。

B.1.5 庚烷。

B.1.6 10%次氯酸鈉溶液。

B.1.7 腸**產毒培養基

B.1.7.1 成分

蛋白胨 20.0 g

胰消化酪蛋白 200 mg(氨基酸)

氯化鈉 5.0 g

磷酸氫二鉀 1.0 g

磷酸二氫鉀 1.0 g

氯化鈣 0.1 g

硫酸鎂 0.2 g

菸酸 0.01 g

蒸餾水 1 000 mL

pH7.2～7.4

B.1.7.2 制法

將所有成分混于水中，溶解后調節pH，121℃高壓**30min。

B.1.8 營養瓊脂

B.1.8.1 成分

蛋白胨 10.0 g

牛肉膏 3.0 g

氯化鈉 5.0 g

瓊脂 15.0 g～20.0 g

蒸餾水 1 000 mL

B.1.8.2 制法

將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內,加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH 至7.2～7.4。加入瓊脂,加熱煮沸,使瓊脂溶化。分裝燒瓶,121℃高壓**15min。

B.2 儀器和設備

B.2.1 電子天平：感量0.01g。

B.2.2 均質器。

B.2.3 離心機：轉速3000 g～5000 g。

B.2.4 離心管：50 mL。

B.2.5 濾器：濾膜孔徑0.2 μm。

B.2.6 微量加樣器:20 μL～200 μL、200 μL～1000 μL。

B.2.7 微量多通道加樣器:50 μL～300 μL。

B.2.8 自動洗板機(可選擇使用)。

B.2.9 酶標儀：波長450 nm。

B.3 原理

本方法可用A、B、C、D、E 型金黃色葡萄球菌腸**分型酶聯**吸附試劑盒完成。本方法測定的基礎是酶聯**吸附反應（ELISA）。96 孔酶標板的每一個微孔條的A~E 孔分別包被了A、B、C、D、E 型葡萄球菌腸**抗體，H 孔為陽性質控，已包被混合型葡萄球菌腸**抗體，F 和G 孔為陰性質控，包被了非**動物的抗體。樣品中如果有葡萄球菌腸**，游離的葡萄球菌腸**則與各微孔中包被的特定抗體結合，形成抗原抗體復合物，其余未結合的成分在洗板過程中被洗掉；抗原抗體復合物再與過氧化物酶標記物（二抗）結合，未結合上的酶標記物在洗板過程中被洗掉；加入酶底物和顯色劑并孵育，酶標記物上的酶催化底物分解，使無色的顯色劑變為藍色；加入反應終止液可使顏色由藍變黃，并終止

了酶反應；以450 nm 波長的酶標儀測量微孔溶液的吸光度值，樣品中的葡萄球菌腸**與吸光度值成正比。

B.4 檢測步驟

B.4.1 從分離菌株培養物中檢測葡萄球菌腸**方法

待測菌株接種營養瓊脂斜面（試管18 mm×180 mm）37 ℃培養24 h，用5 mL生理鹽水洗下菌落，傾入60 mL產毒培養基中，每個菌種種一瓶，37 ℃振蕩培養48 h，振速為100 次/min，吸出菌液離心，8000 r/min 20 min，加熱100 ℃，10 min，取上清液,取100 μL稀釋后的樣液進行試驗。

B.4.2 從食品中提取和檢測葡萄球菌**方法

B.4.2.1 乳和乳粉

將25 g 乳粉溶解到125 mL、0.25 mol/L、pH8.0 的Tris 緩沖液中，混勻后同液體乳一樣按以下步驟制備。將乳于15 ℃，3500 g 離心10 min。將表面形成的一層脂肪層移走，變成脫脂乳。用蒸餾水對其進行稀釋（1：20）。取100μL 稀釋后的樣液進行試驗。

B.4.2.2 脂肪含量不超過40%的食品

稱取10 g 樣品絞碎，加入pH7.4 的PBS 液15 mL 進行均質。振搖15 min。于15℃，3500g 離心10min。必要時，移去上面脂肪層。取上清液進行過濾**。取100 μL 的濾出液進行試驗。

B.4.2.3 脂肪含量超過40%的食品稱取10 g 樣品絞碎，加入pH7.4 的PBS 液15 mL 進行均質。振搖15 min。于15 ℃，3500 g 離心10 min。吸取5 mL 上層懸浮液，轉移到另外一個離心管中，再加入5 mL 的庚烷，充分混勻5 min。于15 ℃，3500 g 離心5 min。將上部有機相（庚烷層）全部棄去，注意該過程中不要殘留庚烷。將下部水相層進行過濾**。取100 μL 的濾出液進行試驗。

B.4.2.4 其它食品可酌情參考上述食品處理方法。

 

B.4.3 檢測

B.4.3.1 所有操作均應在室溫（20 ℃~25 ℃）下進行，A、B、C、D、E 型金黃色葡萄球菌腸**分型ELISA 檢測試劑盒中所有試劑的溫度均應回升至室溫方可使用。測定中吸取不同的試劑和樣品溶液時應更換吸頭，用過的吸頭以及廢液要浸泡到10 %次氯酸鈉溶液中過夜。

B.4.3.2 將所需數量的微孔條插入框架中（一個樣品需要一個微孔條）。將樣品液加入微孔條的A~G孔，每孔100 μL。H 孔加100 μL 的陽性對照，用手輕拍微孔板充分混勻，用粘膠紙封住微孔以防溶液揮發，置室溫下孵育1 h。

B.4.3.3 將孔中液體傾倒至含10 %次氯酸鈉溶液的容器中，并在吸水紙上拍打幾次以確保孔內不殘留液體。每孔用多通道加樣器注入250 μL 的洗液，再傾倒掉并在吸水紙上拍干。重復以上洗板操作4 次。本步驟也可由自動洗板機完成。

B.4.3.4 每孔加入100μL 的酶標抗體，用手輕拍微孔板充分混勻，置室溫下孵育1 h。

B.4.3.5 重復B.4.3.3 的洗板程序。

B.4.3.6 加50μL 的TMB 底物和50μL 的發色劑至每個微孔中，輕拍混勻，室溫黑暗避光處孵育30 min。

B.4.3.7 加入100μL 的2 mol/L 硫酸終止液，輕拍混勻，30 min 內用酶標儀在450 nm 波長條件下測量每個微孔溶液的OD 值。

B.4.4 結果的計算和表述

B.4.4.1 質量控制

測試結果陽性質控的OD 值要大于0.5，陰性質控的OD 值要小于0.3，如果不能同時滿足以上要求，測試的結果不被認可。對陽性結果要排除內源性過氧化物酶的干擾。

B.4.4.2 臨界值的計算

每一個微孔條的F 孔和G 孔為陰性質控，兩個陰性質控OD 值的平均值加上0.15 為臨界值。

示例：陰性質控1=0.08

陰性質控2=0.10

平均值=0.09

臨界值=0.09+0.15=0.24

B.4.4.3 結果表述

OD 值小于臨界值的樣品孔判為陰性，表述為樣品中未檢出某型金黃色葡萄球菌腸**；OD 值大于或等于臨界值的樣品孔判為陽性，表述為樣品中檢出某型金黃色葡萄球菌腸**。

B.5 生物**

因樣品中不排除有其它潛在的傳染性物質存在，所以要嚴格按照GB19489 對廢棄物進行處理。

 

附錄C

（規范性附錄）

金黃色葡萄球菌*可能數（MPN）檢索表

C.1 金黃色葡萄球菌*可能數（MPN）的檢索見表

每g(mL)檢樣中金黃色葡萄球菌*可能數（MPN）的檢索見表C.1。